核酸纯化常见问题分析之二/质粒提取
发布时间:2017-07-27
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1、从柱离心式产品的流行看经典方法的缺点 (或者操作重点)

柱式方法的风行是无法否定的现实。下面通过柱式方法与经典方法的比较,看一看如何注意经典方法的操作重点。

裂解,二者几乎没有任何区别。去蛋白质,柱式靠的是柱材料对蛋白质吸附力低这一特点,将蛋白质残留控制在比较低的水平 (并不是/也不能彻底去除);经典方法最常用的是 PC 抽提,可以将蛋白质去除得更彻底一些。其它大分子杂质 - 如多糖等 - 的去除,柱式的与蛋白质的去除相似,但经典方法中却没有如此方便的对应方法。小分子物 (盐等) 的去除,是柱式方法最优势所在。如果柱子设计没有问题,离心后柱子中残留的液体稳定而少;柱式的洗涤具有“流水洗涤”的效果;柱式中的核酸是不成团块的 - 这三个特点决定了柱式的洗涤效率比经典的洗涤效率高,所以,柱式纯化的核酸纯度比较高。

 

2、  应该使用多少菌液?

根据我们的经验,如为高拷贝质粒(如:pUC118等),使用2 ml培养液与4 ml培养液纯化的质粒DNA的收量差别不是很大,可以纯化到20-25 μg的高纯度质粒DNA。如提取地拷贝质粒或大于10 kb质粒,建议使用5-10 ml的菌液(可分几管收集菌体,按比例加入溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ,再将离心上清分批转移至DNA纯化柱),吸附和洗脱的时间可以适当延长,洗脱时使用的溶液Eluent应在60℃水浴预热。高纯度质粒小提试剂盒所配硅胶柱的最大吸附量是40 μg,满足绝大多数实验所需用量。

 

3、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的用量问题

溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的比例是固定的,如果增加或减少用量都请按比例变化,但是一般来说,用量原则是确保能彻底裂解样品,同时使裂解体系中核酸的浓度适中(具体表现是加入溶液Ⅱ后,能形成澄清的裂解溶液)。浓度过低,将导致沉淀效率低,影响得率;浓度过高,去除杂质的过程复杂且不彻底,导致纯度下降。溶液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的,而不是以核酸含量为基准。

 

4、 溶液Ⅱ操作时要注意的事项

在反应液充分的时候,第一,反应的时间不能过长,长时间的碱性条件会打断DNA,基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100 kb大小的片断,就没有办法再被溶液Ⅲ沉淀了;第二,不得激烈振荡,不然基因组DNA也会断裂最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

 

5、质粒质量检测

将抽提好的核酸直接用于后续的实验,是唯一可靠的检测方法;除此之外的检测方法,都是相对的,而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法,一是电泳,二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围),该方法还是非常可信的;电泳还可以用于估计核酸的浓度,但其准确度与经验有关;另外,电泳也可能提供某些杂质污染的信息,但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量,然而,由于紫外分光光度仪不能确保非常准确,而该仪器的灵敏度又非常高,所以,提供的结果并不十分可信。一般讲,同时进行紫外和电泳检测,综合二者的结果,可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷,所以,即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验,也不用大惊小怪。

 

6、 质粒电泳条带

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时,多数情况下你能看到三条带,但不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA,用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳,就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序,分别是超螺旋、开环和复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡,会有第四条带,这条带泳动得较慢,远离这三条带,是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是,有时候抽提到的质粒会有7-10条带,这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致。

 

7、 核酸的保存

纯化后的核酸,最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解;其中 RNA 以水为主,DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解,认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险;如果操作过程控制得当,DNase 的残留几乎是可以忽略的,完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。基本上,核酸在保存中的稳定性,与温度成反比,与浓度成正比。

如果温度合适,保存中核酸发生降解或者消失,首要原因是酶残留导致的酶解,第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解 (RNA 在弱酸性更稳定,而 DNA 在弱碱性更合适)。还有一个不为人重视的,就是 EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点,那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应,达到某种均衡。EP 管的材质,首先可能吸附核酸,其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化,如变性。在核酸的浓度比较高时,这个现象可能观察不到;当核酸浓度很低时,则比较明显了。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸,虽然已经为实验所证明,但许多实验人员并没有将该建议当回事。现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料,在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多,但其化学特征,尤其是对核酸稳定性的可能影响,远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样,其负面产物可能是,抽提的质粒电泳的构型越来越多:除了原来的三种带型外,还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。

 

8、 核酸抽提中的温度问题

核酸抽提中的温度问题,也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是,任何一个温度条件,对某些方面有利,同时也一定会有不利的一面。如沉淀,低温操作会提高得率,但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好,应该是利弊权衡的结果。基本上,除了一些特殊的步骤,如消化等外,用室温是最好的选择。低温的确可以减低酶的活性,但低温同时也降低了这些酶被裂解液中的试剂灭活或者抑制的速度,此消彼长,没有办法给出结论的。