DNA电泳常见问题分析之一
发布时间:2017-07-27
分享到:

1  请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时,促凝的是TEMED还是过硫酸铵?胶聚时间很长如何解决?

过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基,而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了,过硫酸铵固体时间过久也会失效的。
一个让PAGE胶很快聚合的方法:
不要先配AP(过硫酸铵)溶液,因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下,每次配胶时,直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中,这样可以保证AP的催化能力,而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶,加0.03克AP粉剂,最后加入25ulTEMED,20分钟左右就可以凝固(当然这个时候拔梳子,会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰,使加的样品看起来不太漂亮,但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置)。  

2  DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的?
1、 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1-2mm即可。
2、 电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。
3、 上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。

3  跑出的DNA带模糊?
1、 DNA降解:避免核酸酶污染。
2、 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
3、 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、 DNA上样量过多:减少凝胶中DNA上样量。
5、 DNA样含盐过高:电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
6、 有蛋白污染:电泳前酚抽提去除蛋白。
7、 DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

4  有不规则DNA带迁移?
1、 对于λ/Hind III片段cos位点复性:电泳前于65℃加热DNA 5分钟,然后在冰上冷却5分钟。
2、 电泳条件不合适:电泳电压不超过20V/cm;温度<30℃;经常更换电泳缓冲液。
3、 DNA变性:以20mM NaCl Buffer稀释DNA,电泳前勿加热。

5  跑出的DNA条带带弱或无DNA带?
1、 DNA的上样量不够:增加DNA的上样量;聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高,上样量可适当降低。
2、 DNA降解:避免DNA的核酸酶污染。
3、 DNA走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度。
4、 对于EB染色的DNA,所用光源不合适??应用短波长(254nm)的紫外光源。

6  跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?
1、 如果是小DNA带走出凝胶,可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。
2、 分子大小相近的DNA带不易分辨??增加电泳时间,核准正确的凝胶浓度。
3、 DNA 变性:电泳前请勿高温加热DNA链,以20mM NaCl Buffer稀释DNA。
DNA链巨大,常规凝胶电泳不合适??在脉冲凝胶电泳上分析。

7  做PCR电泳后跑电泳,目的基因是489BP的,结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了,快到600了?为什么?

有时只靠电泳结果判断是不准确的,同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多,结果就跑到1000的marker下面去了,后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样,是490BP.理论上两个条带一样,可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了,后来又拿去做了下一个测序,才知道根本没有问题。

8  跑完PCR,暂时不方便胶回收,条带已经切下来放到ep管里了,这个能保存么?会不会有不良影响?

还有个问题,pcr的产物可以不可以直接拿来做模板再进行pcr。我试过,可是总是出现一个拖尾亮条,没有带,是什么原因呢?
割下来的胶放在-20保存两个星期完全没有问题。切下来的胶放在4度冰箱中4、5小时没有问题回收的效果也很好。

9  凝胶回收DNA实验的关键在哪里?
最关键的是切胶之后,溶胶的那一步.切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净,按照实验步骤,第一步应该是将胶充分的溶化.这以后步一定要做充分,保证凝胶已经完全溶解了.加乙醇这步也很关键,当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。洗脱的时候最好用加热到60度 的洗脱液洗脱,如果实在效果不好可以分两次洗脱。

10  切胶的时候如何能切的准呢?条带的位置肉眼很难判断出来,如何判断条带的位置呢?
可以将产物与Marker一起电泳,染色后,在紫外灯下观察结果,跟Marker进行相比,就知道要的是哪条带。注意,紫外灯下切胶速度要快,否则DNA会降解,另外,紫外线对身体伤害很大,特别是眼睛,请注意采取保护措施(比如在专门的箱子里切,带眼镜等)。RNA 用具要用10%的NaOH浸泡过液,再用DEPC水冲洗干净  70%的乙醇用过 国产分析乙醇有杂质,RNA酶还会有,并带入其它污染。