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通用菌落PCR检测试剂盒(P8011-P8012)

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P8011(50次) P8012(500次)

通用菌落PCR检测试剂盒

Cat. #P8011P8012

产品简介

本试剂盒利用PCR原理,结合本公司的快速DNA聚合酶(延伸速率20s/kb),设计适用性广的最佳引物,优化PCR反应缓冲体系,同时简化检测方法,可用于各种常用T载体克隆的筛选检测。

 

产品组成

Component

P8011

P8012

2× FSTM Mix

500 μl

1 ml × 5

T-primer (10 μM)

50 μl

500 μl

超纯水

1 ml

1 ml × 10

说明书

1

1

 

活性定义

一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

 

保存条件

-20℃保存。

 

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:PCR方法检测本试剂盒无宿主残余DNA,也无其他DNA污染,能有效完成PCR扩增。

 

应用举例

1. 准备样品

将过夜培养的平板上的菌落编号后,用灭菌的牙签挑取单克隆菌体的一部分至反应体系中;或在1.5 ml EP管中分装500 μl含有相应抗生素的LB培养基,并做好标记,用无菌牙签提取单个菌落至上述培养基中,37振荡(250-300rpm)培养4h,取1-2 μl菌液用于扩增。

2. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:

Ordinal

Component

Volume

(20 μl reaction volume)

1

2× FSTM   Mix

10   μl

2

T-primer (10 μM)*

1 μl

3

菌体或菌液

1 μl

4

超纯水

To   20 μl

*包含了上下游引物,扩增大小约为:克隆片段+250 bp

加入各组分后,请用枪头反复吸吹几次,充分混匀。

在一次配制多管需分装时建议按(n+1)的反应液量配制,以确保分配时的耗损不会影响实验,同时选择大于总体积的离心管便于混匀。

如需使用其他体积的PCR反应体系,请按各组分比例缩减或增加各组分用量。

将混匀的各管短暂离心,置于PCR仪中。

 

3. 设定反应程序进行PCR反应

Stage  

Temperature

Time

Number   of Cycles

Initial   Denaturation

94℃

3   min

1

Denaturation

94℃

30   sec

30

Annealing

55℃

30   sec

Extension

72℃

30   sec or 45 sec

Final   Extension

72℃

5   min

1

设定PCR程序时,请根据目的片段大小决定延伸时间,如果目的片段大小为500 bp时,延伸时间为15 sec500 bp-1 kb,延伸时间20 sec;目的片段>1 kb时,延伸时间按20s/kb计算。

 

3. 分析结果

反应结束后取2-5 μl反应产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。

 

注意事项

请严格按照说明书提供的实验体系及实验条件进行试验。

室温下DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加FSTM Mix或模板DNA

挑取菌落时,应选择单菌落,不要挑取太多菌体,以免影响PCR结果。

部分适用T载体参考下表:

公司

T载体

Promega

pGEM-T   Vector

pGEM-T   Easy Vector

Takara

pMD18-T   Vector

pMD19-T   Vector

pMD20-T   Vector

pMD18-T   Simple Vector

pMD19-T   Simple Vector

pSIMPLE-18   EcoR V/BAP Vector

pSIMPLE-19   EcoR V/BAP Vector

Tiangen

pGM-T载体

pBS-T载体

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