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Pfu DNA高保真聚合酶(P1021-P1022-P1023-P1024)

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P1021(250U) P1022*(250U) P1023(1000U) P1024(1000U)

Pfu DNA聚合酶

Cat. #P1021P1022P1023P1024

产品简介

Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶,分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达2 kb(简单模板)。延伸速度为2min/kb70~75℃,简单模板可达20s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,扩增产物具有平末端。

产品组成

Component

P1021

250U

P1022

250U

P1023

1,000U

P1024

1,000U

Pfu DNA聚合酶(5U/μl

50 μl

50 μl

200 μl

200 μl

10× Pfu   BufferMg2+ Plus[1]

1.25 ml

1.25 ml

1.25 ml × 2

1.25 ml × 2

6× Loading Buffer[2]

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

dNTPs2.5mM[3]

-

1 ml

-

1 ml × 2

[1] 10× Pfu Buffer分为Mg2+ PlusMg2+ Free两种包装,可方便选择。如无特别说明提供10× Pfu Buffer(Mg2+ Plus)Mg2+ Free10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl2

[2] 6× Loading Buffer,如有需要可单独购买(Cat. #M9041)。

[3] dNTPsdATPdGTPdCTPdTTP等摩尔混合物,P1021/P1023不含dNTPs,如有需要请单独购买(Cat. #P9011/P9012/P9013)。

活性定义

一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:

Ordinal

Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)

1

10× Pfu   BufferMg2+ Plus

5 μl

2

dNTPs2.5mM

4 μl

0.4 mM

3

upstream primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4 μM

4

downstream primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4 μM

5

Pfu DNA聚合酶(5U/μl[2]

0.5 μl-1 μl

2.5U-5U

6

template DNA[3]

1-4 μl

<1μg

7

超纯水[4]

To 50 μl

-

optional

MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5]

Variable

-

[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度

[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。

[3] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。

Template

Dosage

人类基因组DNA

0.1μg-1μg

λDNA

0.5ng-5ng

大肠杆菌基因组DNA

10ng-100ng

质粒DNA

0.1ng-10ng

[4] 可单独订购超纯水(Cat. #P9021/P9022/P9023)。

[5] 可单独订购25mM MgCl2Cat. #P9031)和PCR EnhancerCat. #P9041)。

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage

Temperature

Time

Number of Cycles

Initial Denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

30 sec

25-35

Annealing

55-68℃[1]

30 sec

Extension

72℃

Variable[2]

Final Extension

72℃

5-10 min

1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。

3. 分析结果

将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR EnhancerCat. #P9041MgCl2Cat. #P9031等可提高产量。

操作注意事项

1 室温下Pfu DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA

2 Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端,可直接用于平末端连接。如要进行TA克隆,请先进行加A反应,以提高克隆效率。(加A反应:参考如下体系,72℃15-30min

PCR(纯化)产物

1-7 μl

10× Taq BufferMg2+ Plus

1 μl

dATP

0.2 mM

Taq DNA聚合酶

5U

超纯水

To 10 μl

碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6

4 dUTPdITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的GC,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。

相关产品

名称

货号

规格

PCR Mix

P2011/P2012/P2013/P2014/P2015

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

Power Green qPCR Mix

P2101/P2102/P2103/P2104/P2105

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

1kb ladder

M1181/M1182

50/250

DSTM5000

M1111/M1112

60/300

高纯度质粒小提试剂盒

N1011/N1012/N1013

50/100/200

通用RNA提取试剂盒

R1051

50

基因组DNA快速提取试剂盒

N1111/N1112

50/100

DNA凝胶回收试剂盒

N1071/N1072/N1073

50/100/200

RT-PCR Kit

R1011/R1012

20/100

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