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高纯度质粒DNA大量提取试剂盒(硅胶沉淀法)(N1041)

价格: 690.00
运费 ¥0.00
N1041(10次)

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产品组分
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溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液PB中含有碱与变性剂,请不要直接接触皮肤。

上述产品组分均可单独购买,详见产品索引。


保存条件

RNase A:-20℃保存。RNase A为浑浊溶液。初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

其他试剂:室温保存。

若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

 

产品说明

本产品采用了经典的硅胶纯化及碱裂法技术,用于高纯度质粒DNA的大量纯化。纯化原理是碱裂解细菌后,硅胶液高效可逆地吸附体系中的质粒DNA(高盐、低

pH值),蛋白及其它杂质不被吸附而被除去,被吸附的质粒DNA在低盐、高pH值条件下再被洗脱出来。一次可从100 ml的过夜培养的菌液中提取400-1000 μg

高纯度质粒DNA(OD260/280 = 1.7-1.9),此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。

 

产品特点

  • 高效:一次可获得400-1000 μg高拷贝质粒DNA。
  • 高纯度:OD260/OD280 = 1.7-1.9。无须再纯化,可直接使用。
  • 灵活:菌体提取规模灵活可控。

 

产品用途

  • 常规限制性酶切
  • PCR扩增
  • 转化
  • DNA序列测定
  • 体外转录

 

质量控制

从大肠杆菌提取pGEM质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。

 

图1  质粒DNA纯化流程图

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操作方法

1  收集100 ml菌液。8,000 rpm离心5min,弃上清。尽量吸除上清,为确保上清液全部吸取,请倒置干净的吸水纸上。

    注:应根据所培养菌体的浓度与拷贝数确定收集的菌液量。如果菌液浓度过低或低拷贝质粒,可收集2次100 ml菌液,并将菌体沉淀收集到一个离心管中。菌体的体积与质

粒拷贝数参见注意事项。

2  加入7.5 ml溶液Ⅰ/ RNase A混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全悬浮。室温静置5-10min。

注:初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

不要残留细小菌块。菌液重新悬浮充分与否对于获得高产量非常重要。

室温静置5-10min是为使溶液中的RNA被充分降解。

3  加入7.5 ml溶液Ⅱ,立即轻柔地反复颠倒混匀12次。室温放置3min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。

    注:若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

            加入溶液Ⅱ后,不可剧烈混和,否则会使染色体DNA断裂。。此时菌液应变得清亮粘稠,如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。

4  加入10 ml溶液Ⅲ,立即轻柔地反复颠倒混匀6-10次。此时会出现白色絮状沉淀。

   注:加入溶液Ⅲ后,应立即混匀避免产生局部沉淀。

5  12,000 rpm室温离心12min,收集上清。

6  将上清置于新的50 ml离心管中。按照每25 ml上清液中加入1.2 ml硅胶纯化液的比例,向所获上清中加入硅胶纯化液。反复颠倒混匀6次直至溶液呈现乳状,

室温放置5min。

     注:加入硅胶纯化液的体积,可根据上清液的量等比例调整。

7  12,000 rpm 离心2min,弃上清液。

    注:此时质粒DNA被吸附于硅胶上并沉淀在管底。

 8  加入10 ml 溶液PB,漩涡振荡使硅胶沉淀完全悬浮。12,000 rpm 离心2min,弃上清液。

    注:此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量质粒DNA。

9  加入10 ml溶液W,漩涡振荡使沉淀完全沉淀悬浮。12,000 rpm 离心2min,弃上清液。

   注:溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

10加入10 ml溶液W,漩涡振荡使沉淀完全沉淀悬浮。12,000 rpm 离心2min,弃上清液。

11用移液器吸干管底及管壁上残留的液体。打开离心管盖,于室温晾干30min(或者超净台吹干15min)。

   注:此步骤的作用是去除残余酒精,避免降低质粒的生物学活性,影响下游酶促反应。

12加入1.5-2 ml溶液Eluent(65℃预热),漩涡振荡使沉淀完全悬浮。室温放置5min,12,000 rpm离心2min。上清液即为质粒DNA溶液,吸取移至一新离心管

于-20℃保存。

    注:溶液Eluent可用无菌双蒸水代替,但其pH需为8.0-8.5,加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。

            对溶液Eluent  65℃预热,会提高提取质粒DNA

的得率。

 

图2  质粒DNA电泳图

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注意事项

1  提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb 的大质粒,应加大菌体使用量。高拷贝质粒推荐使用量

为100ml,得率一般在0.5 mg~1.5 mg 左右;低拷贝质粒推荐使用量为200ml,得率一般在200~400μg。溶液Eluent 应在65℃水浴预热,在吸附和洗脱时可以

适当的延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。

2  所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm(约13,400×g)。

3  所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm(约13,400×g)。

4 溶液 Eluent(10 mM Tris-HCl, pH 8.5)中不含EDTA,其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等,不会影响后续试验。

 

质粒DNA浓度与纯度检测

1  利用紫外分光光度计检测时,OD260值为1 相当于大约50 μg/ml 双链DNA。高纯度的质粒DNA OD260/280通常在1.7-1.9 左右。如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,

而使用去离子水,比值会偏低,但并不表示纯度低,因为pH 值和离子存在会影响光吸收值。

2  利用琼脂糖凝胶电泳检测时,理想情况是只出现单一超螺旋条带。然而,再质粒提取过程中,由于机械剪切、酸碱度等原因,使质粒DNA发生断裂。电泳

时可能出现1-3条带,电泳迁移率从大到小,分别为超螺旋质粒、开环质粒或复制中间体。但是,只要质粒DNA经过单酶切鉴定后(单酶切位点),呈现单

一条带,就表明没有基因组DNA的污染。


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