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Long Taq DNA聚合酶(P1061-P1062-P1063-P1064)

促销: 200.00~760.00
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P1061(250 U) P1062(250 U) P1063(1000 U) P1064(1000 U)

Long Taq DNA聚合酶

Cat. #P1061P1062P1063P1064

产品简介

Long Taq DNA聚合酶是专门用于扩增长片段的嗜热DNA聚合酶,其保真性是普通Taq DNA聚合酶的3倍左右。扩增片段的长度可达20 kb(简单模板)。在扩增复杂模板(如GC-rich或重复序列)时,Long Taq DNA聚合酶的扩增效率显著高于Taq DNA聚合酶。因此Long Taq DNA聚合酶适合>5kbDNA片段及复杂模板的扩增。延伸速度为20s/kb70~75℃,简单模板可达5s/kb)。扩增产物具有两种末端:平末端与3'-dA

产品组成

Component

P1061

250U

P1062

250U

P1063

1,000U

P1064

1,000U

Long Taq DNA聚合酶(5U/μl[1]

50 μl

50 μl

200 μl

200 μl

Long Taq DNA聚合酶(2.5U/μl[1]

100 μl

100 μl

400 μl

400 μl

10× Long PCR Buffer I [2]

1.25 ml

1.25 ml

1.25 ml × 2

1.25 ml × 2

10× Long PCR Buffer II[2]

1.25 ml

1.25 ml

1.25 ml × 2

1.25 ml × 2

6× Loading Buffer[3]

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

dNTPs2.5mM[4]

-

1 ml

-

1 ml × 2

PCR Enhancer[5]

500 μl

500 μl

500 μl× 2

500 μl× 2

[1] 提供5U/μl2.5U/μl两种活性单位的包装可供选择,如无特别说明默认5U/μl

[2] 10× Long PCR Buffer I 是经典的Long Taq DNA聚合酶缓冲液,扩增长片段特别是10 kb以上片段可保证获得最好的扩增效果。10× Long PCR Buffer II是东盛自主研发的Long Taq DNA聚合酶缓冲液,可以显著的提高酶的灵敏度与保真性,在扩增低浓度模板时具有明显优势,但是对长片段(大于13kb片段)的扩增效果不如Buffer I

[3] 6× Loading Buffer,如有需要可单独购买(Cat. #M9041)。

[4] dNTPsdATPdGTPdCTPdTTP等摩尔混合物,P1061/P1063不含dNTPs,如有需要请单独购买(Cat. #P9011/P9012/P9013)。

[5] PCR Enhancer主要通过降低DNA模板的解链温度,促进DNA模板的有效扩增,增加PCR反应的灵敏度和特异性。可单独订购(Cat. #P9041)。

活性定义

一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:

Ordinal

Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final concentration

(50 μl reaction volume)

optional

PCR Enhancer

4-16 μl

-

1

10× Long PCR Buffer I/ II [1]

5 μl

2

dNTPs2.5mM

4 μl

0.4 mM

3

upstream primer (10 μM)[2]

2 μl

0.4 μM

4

downstream primer (10 μM)[2]

2 μl

0.4 μM

5

Long Taq DNA聚合酶(5U/μl[3]

0.5 μl

2.5U

6

template DNA[4]

1-4 μl

<1μg

7

超纯水[5]

To 50 μl

-

optional

MgCl2(MgSO4)[6]

Variable

-

[1] 10× Long PCR Buffer I 10× Long PCR Buffer II 均已添加Mg2+

[2] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。

[3] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。

[4] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。

Template

Dosage

人类基因组DNA

0.1μg-1μg

λDNA

0.5ng-5ng

大肠杆菌基因组DNA

10ng-100ng

质粒DNA

0.1ng-10ng

[5] 可单独订购超纯水(Cat. #P9021/P9022/P9023)。

[6] 可单独订购25mM MgCl2Cat. #P9031)。

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage

Temperature

Time

Number of Cycles

Initial Denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

30 sec

25-35

Annealing

55-68℃[1]

30 sec

Extension

72℃

Variable[2]

Final Extension

72℃

5-10 min

1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按20s/kb来设最佳(简单模板可达5s/kb)。

3. 分析结果

将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR EnhancerCat. #P9041MgCl2Cat. #P9031等可提高产量。

操作注意事项

1 室温下Long Taq DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Long Taq DNA聚合酶或模板DNA

2 Long Taq DNA聚合酶的扩增产物有两种末端:平末端和3'-dA突出末端。如要进行TA克隆,请先进行加A反应,以提高克隆效率。(加A反应:参考如下体系,72℃15-30min

PCR(纯化)产物

1-7 μl

10× Taq BufferMg2+ Plus

1 μl

dATP

0.2 mM

Taq DNA聚合酶

5U

超纯水

To 10 μl

3 Long Taq DNA聚合酶既可扩增长片段的DNA,也可扩增小片段(几百bp)的DNA

4 PCR Enhancer主要在Long Taq DNA聚合酶扩增无结果或扩增效果不好时使用。使用后退火温度需在原温度上降低2-3℃,否则会降低PCR效率,建议使用Tm值较高的引物。PCR Enhancer能够与所有的耐热DNA聚合酶共同作用。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的GC,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。

相关产品

名称

货号

规格

PCR Mix

P2011/P2012/P2013/P2014/P2015

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

Power Green qPCR Mix

P2101/P2102/P2103/P2104/P2105

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

1kb ladder

M1181/M1182

50/250

DSTM5000

M1111/M1112

60/300

高纯度质粒小提试剂盒

N1011/N1012/N1013

50/100/200

通用RNA提取试剂盒

R1051

50

基因组DNA快速提取试剂盒

N1111/N1112

50/100

DNA凝胶回收试剂盒

N1071/N1072/N1073

50/100/200

RT-PCR Kit

R1011/R1012

20/100

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