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SYBR Green qPCR Mix(P2091-P2092-P2093-P2094-P2095)

促销: 300.00~18900.00
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P2091(1ml) P2092(1mlx5) P2093(1mlx10) P2094(1mlx50) P2095(1mlx100)

SYBR® Green qPCR Mix

Cat. #P2091P2092P2093P2094P2095

产品简介

SYBR® Green qPCR Mix2X浓缩的实时定量PCR预混液,使用时只需加入模板和引物即可进行反应。本品含有基于核酸适配子(Aptamer)的抑制剂,能够与DNA聚合酶可逆结合。当温度低于45℃时与聚合酶结合抑制其活性,当温度达到94℃时与聚合酶分离激活酶活性,从而可以减少引物二聚体和其他次级产物对反应的干扰。同时,本品中的DNA聚合酶是经过化学修饰的热启动版的Taq DNA聚合酶,在室温下活性被抑制,从而可以避免非特异性延伸。采用这种双重热启动机制可以显著提高定量PCR的特异性。本品可与常见定量PCR仪完美兼容,如ABIRocheBio-Rad等。

产品组成

Component

P2091

P2092

P2093

P2094

P2095

2X SYBR® Green qPCR Mixa

1 ml

1 ml × 5

1 ml × 10

1 ml × 50

1 ml × 100

超纯水

1 ml

1 ml × 5

-

-

-

a 包含SYBR® Green IHotstart Taq DNA聚合酶,AptamerdNTP及反应缓冲液等。

保存条件

SYBR® Green qPCR Mix -20℃避光保存2年,4℃避光可短期保存。

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:经不同来源的模板和引物检测,产品具有优秀的特异性、灵敏性及可重复性等。

应用举例

1. 配制反应体系

Component

Volume

Final   concentration

DNA template[1]

0.5-2 μl

1-4 μl

Variable

Forward primer (10 μM)[2]

0.2 μl

0.4 μl

0.2 μM

Reverse primer (10 μM)

0.2 μl

0.4 μl

0.2 μM

2X SYBR® Green qPCR Mix[3]

5 μl

10 μl

1X

ddH2O

Variable

Variable

-

Total volume[4]

10 μl

20 μl

-

[1] DNA模板建议用量(10-20 μl体系):1-10 ng cDNA,或10-100 ng gDNA。加样体积不宜过小,以免造成较大的误差,但是cDNA的量不宜超过总体积的1/10。因此模板建议浓度(加样前):cDNA 1-10 ng/μlgDNA 10-100 ng/μl

[2] 引物终浓度建议范围:0.2-0.6 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。

[3] 如果熔解曲线出现杂峰,可以减少Mix用量至8 μl20 μl体系);如果对痕量模板的检出率较低,可以增加Mix用量至12 μl20 μl体系)。

[4] 建议总体积不小于10 μl,以免造成较大的加样误差。具体体积范围参考仪器说明。

注意:对于某些固定型号的仪器,需要添加ROX才能精确测定Ct值。ROX会给熔解曲线分析造成一定的背景干扰。因此,为了避免ROX的杂峰背景干扰,在应用软件的“Passive Reference Dye”中不要选择检测ROX荧光值选项,然后再进行数据的收集与分析。由于ROX的使用体积较小,建议将ROX提前与qPCR Mix混匀使用。ROX用量参照具体仪器说明,下表仅供参考。

Instruments

ROX (100X)

ABI PRISM 7000/   PRISM 7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700

1-2% (High ROX)

ABI 7500/ 7500   Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/   Mx4000

0.2% (Low ROX)

Bio-Rad CFX96/   CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96;   Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf   MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler

No ROX

 

2. 设定反应程序进行qPCR反应

注:本品含有热启动酶,在60℃时会抑制酶活性,因此不建议使用两步法,推荐使用经典三步法或极速三步法。

经典三步法程序示例如下:

Stage

Temperature

Time

Cycle

Initial denaturation

94

3 min

1

Denaturation

94

15 sec

40

Annealing

55-65[1]

15 sec

Extension

72

20 sec

Dissociation/Melting curve analysisoptional[3]

本品可用极速三步法快速完成反应,程序示例如下:

Stage

Temperature

Time

Cycle

Initial denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

5 sec

40

Annealing

55-65℃[1]

5 sec

Extension

72℃

5-10 sec[2]

Dissociation/Melting curve analysisoptional[3]

[1] 最适退火温度需要摸索。退火温度一般设定为所用引物的Tm-5℃,若低于55℃,则以Tm值为退火温度,一般不低于55℃

[2] 150 bp以内的扩增子可设置为5 sec150-300 bp的扩增子可设置为10 sec300 bp以上的扩增子可适当延长时间。

[3] 不同仪器熔解曲线采集程序不同,一般按仪器默认熔解曲线采集程序即可。可在延伸(三步法)或退火延伸(两步法)阶段采集信号,也可在反应结束后72 hrs之内采集(避光低温保存)。

3. 分析结果

观察扩增曲线;调整基线,计算Ct值;观察熔解曲线检测特异性;进行相对或绝对定量。

注意事项

 使用前Mix需要完全解冻,充分混匀。尽量避免多次反复冻融。短期使用可避光保存于4℃

‚ 将(n+x)份反应液混匀后再分注到n个单管中,可降低加样误差。(n为重复次数,x为损耗量,一般为n1/10

ƒ ABI的定量仪器大部分需要ROX校正管间差异,Bio-Rad的定量仪器不需要ROX校正。具体仪器请参照其使用说明。

„ 轻轻混匀反应液,避免产生气泡,气泡会干扰荧光检测。可瞬时离心去除气泡。

… 引物的特异性、用量以及退火温度是影响实验结果的重要因素。务必设计特异性好的引物,随实验结果适当调整引物用量(0.05-0.9 μM——特异性较差时减少引物用量,或以3℃为增量提高退火温度,扩增效率较低时增加引物用量。

† DNA模板的量应小于500 ng/反应,过高的模板量会引起非特异性扩增。应根据模板类型与基因表达量适当调整用量。

‡ 熔解曲线的采集不是必须的,初次使用的引物建议进行熔解曲线采集。熔解曲线可以看出产物的特异性。产物特异性不好的原因有:引物特异性低;退火温度设置偏低;引物/模板浓度偏高;等。同时,建议通过琼脂糖凝胶电泳检测产物的特异性。

相关产品

名称

货号

规格

PCR Mix

P2011/P2012/P2013/P2014/P2015

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

Power Green   qPCR Mix

P2101/P2102/P2103/P2104/P2105

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

1kb ladder

M1181/M1182

50/250

DSTM5000

M1111/M1112

60/300

高纯度质粒小提试剂盒

N1011/N1012/N1013

50/100/200

通用RNA提取试剂盒

R1051

50

基因组DNA快速提取试剂盒

N1111/N1112

50/100

DNA凝胶回收试剂盒

N1071/N1072/N1073

50/100/200

RT-PCR Kit

R1011/R1012

20/100

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