RT-PCR Kit（逆转录试剂盒）

产品说明

RT-PCR Kit(逆转录试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的、具有高灵敏度的RT-PCR反应系统。该系统合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，优化的体系保证了M-MLV具有高效的逆转录酶活性，所得cDNA对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，可用于检测稀有基因的表达、从极少数细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。

M-MLV逆转录酶是由一个71 kD的单亚基组成的重组型DNA逆转录聚合酶。可以催化以RNA或DNA：RNA杂交链为模板的互补DNA 的聚合反应。本酶经修饰RNase H活性比普通的逆转录酶要弱很多，因此在合成第一链cDNA的过程中，可保证RNA的降解程度较低，从而使得率提高。

产品组分

R1011可进行20次逆转录反应,R1012可进行100次逆转录反应（20 μl 标准PCR反应体系，每次使用 M-MLV 1μl）。

M-MLV 储存液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

200 mM NaCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01% NP-40

50% glycerol

5xfirst-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

375 mM KCl

15 mM MgCl2

50 mM DTT

质量检测

逆转录酶活性检测

使用[32P]dCTP作为标记，200 U的 M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA为模板进逆转录反应，最低可得到120ng的cDNA，所得cDNA长度 > 全长的90%。

核酸外切酶活性检测

混合50ng的标记DNA 或RNA与200U M-MLV在1×反应缓冲液体系中，37℃温浴1 h，检测DNA和RNA降解都不到总量的1%。

适用范围

第一链cDNA 合成

cDNA文库构建

RT-PCR

引物延伸

3'和5' RACE

注意事项

l  成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或 SDS。用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能用高压灭菌处理时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。

l  为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2 M同时加入4倍体积的乙醇，室温放置3-5 min，10,000 rpm离心5 min。

l  在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂（RNasin）以增加cDNA合成的长度和产量。在第一链合成反应中，RNase抑制剂在缓冲液和还原剂（如 DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放出RNase。但是RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C 对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了RNase抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。

l  较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加反应的产量。

l  使用简单的RNA纯化方法即可获得满足RT-PCR反应的RNA，但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。

l  为防止RNA降解，应尽量避免反复冻融，最好保存于-70℃。

l  最佳的PCR反应条件，因PCR扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下control反应，以确定最佳的PCR反应条件。

l  cDNA产物应置于-20℃保存。

l  当以cDNA为模板进行PCR之前，使用RNase H处理cDNA，可以提高PCR反应的灵敏度。

操作步骤

1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物

1-5μg RNA

1μl Oligo(dT)₁₅ 或Random primer，

补RNase-free ddH₂O至13.4μl；

2进行变性退火反应

70℃温浴5 min,

简短离心后冰浴5 min；

3在上述离心管中配制反转录反应液

4 μl  5×first-strand buffer

1 μl  dNTPs（10 mM each）

0.6μl  RNasin ,

1 μl   M-MLV；

4按下列条件进行反转录反应

Oligo (dT)₁₅ ：42℃温浴60 min；

Random primer： 37℃温浴60 min。

5终止反应

70℃温浴5 min终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。

6用RNase-free ddH₂O将反应体系稀释到50μl，取2-5μl进行PCR扩增反应。