TRAzol

产品说明

TRAzol可以从动物组织、植物材料、各种微生物以及培养细胞等组织材料中提取总RNA。样品在TRAzol中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（下层），RNA分布在上清层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。经本制品提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，提取的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。

产品组分

需要自备氯仿、异丙醇、RNase-free 75%乙醇、DEPC处理水（R2041/R2042）

保存条件

室温运输，2-8℃避光保存。

注意事项

●   TRAzol具有腐蚀性，操作过程中应做好防护，避免直接接触皮肤或吸入口鼻。沾染后应立即用大量清水冲洗，必要时请就医处理。

●   严防操作环境、使用的容器、耗材和试剂的RNase污染。操作过程中勤换手套。

●   根据起始材料量的不同使用不同体积的溶液（见下表）。过多或过少的使用量都可能影响RNA的质量或产量。若起始材料量很少，RNA预计产量很低，在异丙醇沉淀时，可加入20 mg/ml肝糖原溶液0.5-1 μl促进RNA沉淀。

●   不同起始材料试剂用量及TRAzol用量。

●   使用本产品提取的RNA一般不含有DNA污染。在极少数情况下（与组织pH值等相关），如果有DNA污染而又必须去除，则可以用RNase-free的DNase处理样品。

●   防止DNA污染方法：a. 减少样本起始用量，如将100 mg的植物组织减少为50 mg，将30 mg的动物组织减少为10 mg；

                      b. 在加入TRAzol之后加入5-10 ul 3M NaAc(pH5.2)。

●   请严格遵照操作步骤操作。

●   有关RNA的吸光度说明如下：

260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD₂₆₀/OD₂₈₀（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8-2.0之间，当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TE Buffer。

●   RNA浓度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）×稀释倍数×0.04 μg/μl

操作步骤

1.      实验样品的研磨和匀浆

A. 贴壁培养细胞

倒出培养液，用1X PBS清洗一次，每10 cm²生长的培养细胞中加入1ml的TRAzol，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞）。将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。室温静置5 min。

B. 悬浮培养细胞

将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 rpm，4℃离心2 min，弃上清，向每10⁷个细胞中加入l-2 ml的TRAzol。用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温静置5 min。

C. 动物组织、植物材料样品

将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的TRAzol，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的TRAzol的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。将匀浆液转移至离心管中，室温静置5 min。12,000 rpm 4 ℃离心5 min，小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。

2.      Total RNA的提取

1  向上述步骤中的匀浆裂解液中加入氯仿（TRAzol的1/5体积量），盖紧离心管盖，用力振荡（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置2 min。

2  12,000 rpm 4 ℃离心10 min。

3  从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色层及带有颜色的下层有机相，吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。

（如样品含有较多多糖多酚，请增加以下步骤：在上清液中加入0.2X上清液体积的5 M NaCl及1X上清液体积的酚/氯仿（1:1），混匀，12000 rpm离心5-10 min ，取上清液加入等体积氯仿，混匀，12000 rpm 离心 5-10 min，至第4步。）

4  向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30℃下静置10 min。

5  12,000 rpm 4℃离心10 min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。

3.      RNA沉淀的清洗

小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1 ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 rpm，4 ℃离心2 min后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇），重复洗涤一次。

4.      RNA的溶解

室温干燥沉淀2-5 min（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。